基于我们有的HLA序列，可以和HLA序列的数据库比较，看与哪个HLA allele最相似。

HLA （human leukocyte antigen，人类白细胞抗原）是人类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）的表达产物，根据HLA抗原结构、功能及组织分布的不同，分为I类，II类，III类分子，其中I类分子包括HLA-A，-B，-C系列抗原，广泛分布于各组织有核系统表面。

BLAST表示局部比对搜索工具，用来将新的序列与已有的数据库中的序列进行比较，可以发现区域的相似性，进而为功能和进化研究提供线索。 EBI（欧洲生物信息学中心）提供基于IPD-IMGT/HLA（IMGT国际免疫遗传学数据库）数据库的BLAST库。BLAST工具会搜索数据库中的HLA allele的核苷酸、蛋白质及相关对的序列。

HLA BLAST在线服务的链接如下： https://www.ebi.ac.uk/Tools/services/web_ncbiblast/toolform.ebi?tool=ncbiblast&context=nucleotide&database=imgthla

VCFTOOLS

得到SNP

1

vcftools --vcf X.vcf --remove-indels --out X.snps --recode --recode-INFO-all

得到INDEL

1

vcftools --vcf X.vcf --keep-only-indels --out X.indel --recode --recode-INFO-all

分析带UMI标签的测序数据

检测癌组织的低频突变，为了提高检测低频突变的灵敏度，往往进行高深度的测序。但样本之间存在交叉污染，测序有存在一定概率的错误，这些因素会导致高深度测序过程中将假阳性的信号放到，得到假阳性的结果。解决交叉污染的方法，有公司比如IDT采用唯一配对的样本index，只有配对的index中的reads才属于特定样本。解决测序错误的方法，研究人员在建库的时候，先对分子加上UMI碱基，unique molecular identifier -> UMI，然后根据来源于同一个分子的测序数据进行测序错误修正，得到正确的分子序列。两种方法结合可以减少交叉污染提高准确性（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5759201/）。

如图中所示，左侧一个分子被测了5次，其中第二次有一个测序错误，但该错误并没有在每个测序数据中出现，所以在后续合成一个分子的时候，测序错误被修正，只保留了真正的突变。（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5852328/）

常规的肿瘤配对测序分析，或者遗传性突变位点的分析，并不需要UMI信息，所以包含UMI的数据分析是需要不一样的分析流程来得到准确的分析结果，其中包括提取UMI分子标签，合并来自同一个分子的测序reads，低频突变检测而非胚系突变检测等。

大致流程为：

ubam是Unmapped BAM Format，是BAM文件的一个变种，里面的read是未经map的。大部分测序供应FASTQ文件，这是最常见的测序分析的起始文件。FASTQ文件的优势是，压缩比比bam文件好，解压速度快。

但与ubam文件相比，FASTQ并不是最理想的：

1）单个文件更容易分析

在双端测序中，有些软件希望配对的reads放在一个文件中，有些希望配对的文件，有些软件直接根据read在文件中的位置判断read是否配对，当然现在FASTQ通过在文件中加入/1和/2来表明配对的read解决这一问题。在生信分析的时候，一个FASTQ文件往往和另一个FASTQ文件关联配对，比如R1和R2，往往会花费更多时间来验证read是否配对。但如果通过bam文件的话，会更简单。只需要在FLAG这个地方加入对应的值，比如77和141，就能指定。单个文件更加简单，能储存更多metadata的信息。

在测序的时候，我们先拿到的是样本fastq压缩后的gzip文件，这个时候可能最关心的是数据量够不够，那么fastq.gz文件大小和测序数据量有什么关系呢。

我用Miseq测序数据（gz文件200M左右），Hiseq panel（gz文件50M左右）和WES测序数据（gz文件4G左右）进行了简单的分析。有意思的地方是，虽然R1和R2的数据量是一样的，解压出来的文件大小是一样的，但R2的gzip文件总比R1大。不管是Miseq还是Hiseq的panel测序，压缩后的R2均大于R1文件，且文件越小，差异越大。