SpliceMap官网示例教程

2019-03-21
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SpliceMap是一个从头开始发现和比对splice junction的工具。它提供高敏感度并且支持任意长度RNA-seq 序列片段read长度. SpliceMap将RNA-seq reads比对到参考基因组上用于发现splicing junctions. 它至少拥有与当前技术条件下其它分析工具同等的灵敏度和特异性。

官网 http://web.stanford.edu/group/wonglab/SpliceMap/manual.html

下载 http://web.stanford.edu/group/wonglab/SpliceMap/download.html

示例教程 https://web.stanford.edu/group/wonglab/SpliceMap/tutorial.html

以官网SpliceMap 3.3.5.2 example (Linux-x86 64bit)为例，介绍如何用来自21号染色体的100k 条100bp的RNA reads寻找junction。

测试是否正常./bin/runSpliceMap，如果报错的话，需要到src文件夹运行 ./install.sh ../bin来安装SpliceMap，运行./install-bowtie.sh ../bin来安装

示例文件夹下面的结构

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ls SpliceMap3352_example_linux-64
all.gene.refFlat.txt  bin  data  genome  INSTALL  LICENSE  output  run.cfg  src  temp
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Pacbio三代测序Primary Analysis Data文件夹

2019-03-20
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三代测序很多年了，刚工作的时候在超算中心做过三代的拼接，没好好研究过之后就再也没接触过，现在要做三代的项目，从头学习，Primary Analysis Data为初步数据分析文件夹，类似下面的文件夹结构

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/path/to/secondary/storage/2420294/0011
├── Analysis_Results
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.1.bax.h5
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.1.log
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.1.subreads.fasta
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.1.subreads.fastq
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.2.bax.h5
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.2.log
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.2.subreads.fasta
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.2.subreads.fastq
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.3.bax.h5
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.3.log
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.3.subreads.fasta
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.3.subreads.fastq
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.bas.h5
│   ├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.sts.csv
│   └── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.sts.xml
├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.1.xfer.xml
├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.2.xfer.xml
├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.3.xfer.xml
├── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.mcd.h5
└── m140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0.metadata.xml

主要文件有

bas.h5文件和bax.h5文件

bas.h5和相关的bax.h5文件是PacBio@RS II初级分析（primary analysis）的主要输出文件，这些文件由设备产生到本地存储位置，作为后续SMRT分析软件进行alignment、consensus和variant分析的输入文件。 PacBio@RS II之前，单个bas.h5文件包含了所有测序数据，随着PacBio@RS II升级，通量和read长度都在增加，现在包含一个bas.h5和3个bax.h5文件（1-3.bax.h5）。bax.h5文件包含测序的base call的信息，bas.h5是三个bax.h5的重要指针。 用h5dupm -n [movie name].bas.h5命令看一下文件

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FILE_CONTENTS {
 group      /
 group      /MultiPart
 dataset    /MultiPart/HoleLookup
 dataset    /MultiPart/Parts
 }
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EBI提供HLA序列BLAST

2018-09-14
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基于我们有的HLA序列，可以和HLA序列的数据库比较，看与哪个HLA allele最相似。

HLA （human leukocyte antigen，人类白细胞抗原）是人类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）的表达产物，根据HLA抗原结构、功能及组织分布的不同，分为I类，II类，III类分子，其中I类分子包括HLA-A，-B，-C系列抗原，广泛分布于各组织有核系统表面。

BLAST表示局部比对搜索工具，用来将新的序列与已有的数据库中的序列进行比较，可以发现区域的相似性，进而为功能和进化研究提供线索。 EBI（欧洲生物信息学中心）提供基于IPD-IMGT/HLA（IMGT国际免疫遗传学数据库）数据库的BLAST库。BLAST工具会搜索数据库中的HLA allele的核苷酸、蛋白质及相关对的序列。

HLA BLAST在线服务的链接如下： https://www.ebi.ac.uk/Tools/services/web_ncbiblast/toolform.ebi?tool=ncbiblast&context=nucleotide&database=imgthla

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分析带UMI标签的测序数据

2018-07-31
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分析带UMI标签的测序数据

检测癌组织的低频突变，为了提高检测低频突变的灵敏度，往往进行高深度的测序。但样本之间存在交叉污染，测序有存在一定概率的错误，这些因素会导致高深度测序过程中将假阳性的信号放到，得到假阳性的结果。解决交叉污染的方法，有公司比如IDT采用唯一配对的样本index，只有配对的index中的reads才属于特定样本。解决测序错误的方法，研究人员在建库的时候，先对分子加上UMI碱基，unique molecular identifier -> UMI，然后根据来源于同一个分子的测序数据进行测序错误修正，得到正确的分子序列。两种方法结合可以减少交叉污染提高准确性（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5759201/）。

如图中所示，左侧一个分子被测了5次，其中第二次有一个测序错误，但该错误并没有在每个测序数据中出现，所以在后续合成一个分子的时候，测序错误被修正，只保留了真正的突变。（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5852328/）

常规的肿瘤配对测序分析，或者遗传性突变位点的分析，并不需要UMI信息，所以包含UMI的数据分析是需要不一样的分析流程来得到准确的分析结果，其中包括提取UMI分子标签，合并来自同一个分子的测序reads，低频突变检测而非胚系突变检测等。

大致流程为：

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