在培训部门同事的时候，发现刚开始学生信的人，只是在学如何运行命令，但对自己手头的文件格式和内容却不了解，这对分析的流程的深入理解和研究是非常不好的，所以刚学习的人，应该在等待分析结果的时候，多去了解下文件的内容，程序的大体算法等，这对以后的工作优化是非常有好处的。本文简单介绍一下Fastq的文件格式，希望新手多查文档，多了解自己接触的东西。

文库构建和测序

DNA分子会通过超声波或者酶被打断成几百碱基的小片段，然后在小片段DNA分子的两端添加接头，便于测序和样本区分。当然现在也有转座酶技术，通过转座酶同时实现DNA片断化和加接头和引物的过程。将文库上机，文库中的DNA分子首先与flowcell上lane中的接头结合，通过桥式PCR进行扩增（cluster簇增长），待达到一定量之后，进行便合成边测序。

测序数据的产生

每进行一个cycle，测序仪会合成过程中产生的荧光进行拍照分析，将产生的数据记录在bcl（base calling）文件，测序仪后续会将bcl文件转化成fastq文件，并同时进行demultiplexing。Demultiplexing会将属于同一Index的reads放在同一个fastq文件中，就个过程是Illumina测序仪自动化进行的，如果涉及更复杂参数的demultiplexing，可以下载illumima的bcl2fastq程序，指定相关文件夹即可自己进行demultiplexing。因为在测序上机之前，会在测序仪中设置样本对应的index，这样通过demultiplexing，测序仪对每个样本产生一对fastq文件。Illumina测序仪会自动将拍照形成的bcl文件转换成FASTQ文件。此文件为数据分析的开始。

FASTQ文件格式简介

Paired End(PE)测序，会生成的一对FASTQ文件，分别为R1和R2，正是因为双端测序的产生，使得序列拼接和比对更加准确，因为如果单端的话，只能依靠单端read的长短信息，如果双端的话，能依靠整个插入DNA片断长度的信息，通过判断配对序列的相近距离，确认reads的位置，减少了read比对到多个地方的情况发生。 配对的reads分别在两个FASTQ文件中，其中一个FASTQ文件的内容如下，每四行表示一条read：

1
2
3
4

@M00001:22:000000000-FC706VJ:1:1101:20899:2936 1:N:0:10
GTCCAGAAGGGAGCTTTCACCAGAACCCGACCATGCTGGAACTCTGATCTTGGACTTCCAGCACCCAGACCTGTGAGAAATAAATTTCCGTTGCCCCCTAGTTTATGGTAATTTGTTATAGCAGCCCAAACGAACGAAGACAATTGTATA
+
BAABBFFFFF?BGGGBFGGGGGHCGHHGGGGGGFFCFHGHGCFHGFGHHHHHHGHFHGDGFFHHGGGGHGHHHDGHHHFFHHHGHHFG4EHHGCFFFGGGGFHFFHHFEGHHFHGGHHFHHHHF2GGHHHGGEEFCFGGDHG/\F2DFFBG

• 第一行以@字符开头，后面跟测序仪的编号和其他描述信息。

1

@M00001:22:000000000-FC706VJ:1:1101:20899:2936 1:N:0:10
M00001 测序仪设备编号
22 the run id
FC706VJ the flowcell id
1 the flowcell lane
1101 tile number within the flowcell lane
20899 ’x’-coordinate of the cluster within the tile
2936 ’y’-coordinate of the cluster within the tile
1 the member of a pair, 1 or 2 (paired-end or mate-pair reads only)
N Y if the read is filtered, N otherwise
0 0 when none of the control bits are on, otherwise it is an even number
10 a sample number (as taken from the sample sheet) in place of an index sequenc

• 第二行为测序的原始序列 • 第三行一般为字符+ • 第四行表示第二行序列中每个碱基的质量，即每个碱基的可靠性。因为每个碱基都有一个质量，所有第四行的字符数与第二行的字符数一样多。质量又与Phred score有关。后续的序列预处理和比对会参考测序碱基的Phred质量分值。 假设第二行的一个碱基在测序过程中被识别错误的概率为e（由测序仪计算产生），则该碱基的质量即Phred score的可以表示为Q_phred=-10〖log〗_10 e，即e取对数，乘以-10。错误率越低，碱基的Phred score质量值越高。IlIumina最新的现在的分值范围为0到41。 碱基的Phred质量分值与错误率的对应关系为。

Phred Quality Score Probability of incorrect base call Base call accuracy
10 1 in 10 90%
20 1 in 100 99%
30 1 in 1000 99.9%
40 1 in 10,000 99.99%

该碱基的Phred质量分值还需要换算成FASTQ中第四行的字符。将碱基的Phred质量分值加上33，得到的数换成对应的ASCII编码字符，即得到第四行中对应的字符。对应关系如下。

此时又叫做Phred+33，以前还有Phred+64，即将phred分值加上64后换成对应的ASCII编码字符。

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